一、基因构建到pYX212载体的操作流程
1.载体选择与基因克隆
- pYX212是一种酵母表达载体，含有多克隆位点（MCS）和抗生素筛选标记。需通过PCR扩增目标基因（如研究中的脲基酰胺酶基因dur1,2），并在引物中引入与载体匹配的酶切位点。
- 使用限制性内切酶（如EcoRI、BamHI等）对载体和目标基因进行双酶切，通过TA克隆或Gibson组装法将目标基因插入载体MCS中。
2.共转载体构建
- 研究中采用pyx212-shble作为共转载体，该质粒携带Sh ble基因（博莱霉素抗性标记），用于后续阳性转化子筛选。需确保共转载体与重组载体具有相容的复制元件。
3.质粒转化酵母
·醋酸锂转化法：
- 将酵母菌株（如JF501）接种于YPD培养基，30℃培养至OD600≈1.0。
- 离心收集菌体，用无菌水洗涤后重悬于0.1 M醋酸锂溶液。
- 加入重组质粒（pyx212-dur1,2）和共转质粒（pyx212-shble），42℃热激20分钟。
- 涂布于含Zeocin（100-500 μg/mL）的YP选择培养基，30℃培养2-3天。
二、关键筛选与验证步骤
1.抗生素筛选
- 利用Sh ble基因对Zeocin的抗性，筛选成功转入载体的酵母菌落。需通过梯度实验确定抗生素最适浓度（文献中未明确剂量，建议预实验测试50-200 μg/mL范围）。
2.PCR鉴定阳性克隆
- 使用特异性引物（如文献表1中的引物5和引物2）进行菌落PCR，验证目标基因是否整合到基因组或载体中。扩增产物需通过琼脂糖电泳确认片段大小。
3.功能验证
- 通过发酵试验检测目标基因表达效果。例如，研究中通过测定尿素含量验证dur1,2基因过表达对氨基甲酸乙酯生成的影响，可采用二乙酰一肟显色法或HPLC检测尿素浓度。
三、注意事项
- 载体特性：pYX212为多拷贝载体，需注意基因表达剂量对酵母生长的影响。建议使用诱导型启动子（如GAL1）避免组成型高表达导致的代谢负担。
- 质粒纯度：转化前需通过质粒提取试剂盒获得超螺旋质粒，避免开环DNA影响转化效率。
- 菌株兼容性：确认宿主菌株（如JF501）对pYX212载体的复制起始位点（如2μ origin）具有兼容性。
- 筛选优化：若转化效率低，可尝试延长热激时间至30分钟或加入10% PEG 3350促进DNA吸收。
四、实验失败排查建议
具体参数可根据实验体系微调。建议在正式实验前进行小规模预实验优化条件，希望可以帮到你~
加油！